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技术资料/正文
细胞因子检测全解析，这13个宝藏技术你必须知道-（中）
189 人阅读发布时间：2025-06-19 14:39
多指标检测技术
液相悬浮芯片技术Luminex
与ELISA类似，Luminex技术也使用双抗体夹心法，其关键创新在于将抗体固定在微球表面。由于微球表面可包被大量抗体，因此大大增加了反应的表面积，提高了检测的灵敏度。
图：Luminex检测原理4
通过使用两种或三种不同的染料，并以不同比例对微球进行染色，可产生多达100种或500种不同颜色的微球。每种颜色的微球都具有独特的编码，并且只固定包被一种抗体，从而实现了编码与靶标的一一对应。由于微球是液态的，可将多种不同编码的微球混合在一起，放入同一个孔中。加入样本和检测抗体后，即可在一个样本中同时检测多种蛋白质。
图：Luminex多色微球
图：Luminex如何实现多指标检测
以同样检测20个指标为例比较Elisa和Luminex的不同，可见当样本量有限但需要检测的靶标众多时，Luminex技术更高效、更节省样本，且性价比更高，是目前应用最为广泛的多指标检测技术之一。
|
比较项目 |
Luminex |
Elisa |
|
检测靶标数量 |
20 |
20 |
|
样品数量 |
80 |
80 |
|
检测靶标组合 |
自由组合 |
单项检测 |
|
需96孔板数量 |
1块 |
20块 |
|
耗时 |
4-6个小时 |
＞4天 |
|
所需样品体积 |
25-50ul |
≥20*50μL |
|
重复性 |
同板操作影响少 |
多板检测人为因素多 |
|
单指标费用 |
低 |
高 |
❖检测平台：Luminex200、FLEXMAP 3D、MAGPIX
❖反应容器：96或384孔板
❖单孔可检测指标数：1~115
❖样本种属：人、小鼠、大鼠、非人灵长类、犬、猫、牛、马、猪、鸡、羊
❖可检测样本类型：血清、血浆、细胞上清、尿液、组织裂解液、乳汁、唾液、房水、脑脊液、支气管肺泡灌洗液等多种样本类型
❖所需样本体积：25-50μL
❖灵敏度：pg/ml
❖线性范围：3.5- 5.5 logs
❖实验步骤：
详细实验流程，以Human Luminex® Discovery Assay（LXSAHM）为例
1. 准备所有试剂、标准品和样品。
2. 向每孔加入 50 μL的标准品或样品。
3. 通过倒置或涡旋振荡来重悬稀释后的微球混合物。每孔中加入 50 μL微球混合物。用箔纸密封板。在设定转速为 800 ± 50 rpm 的水平轨道微孔板摇床上，室温孵育 2 小时。
4. 使用磁力洗板机进行清洗，将磁铁置于微孔板底部，等待 1 分钟后移除液体，向每孔加入 100 μL洗涤缓冲液，并再次等待 1 分钟后移除液体。重复此清洗步骤三次。
5. 向每孔加入 50 μL稀释后的生物素-抗体混合物。用箔纸密封板，并在设定转速为 800 ± 50 rpm 的摇床上，室温孵育 1 小时。
6. 如步骤 4 所述重复清洗。
7. 向每孔加入 50 μL稀释后的链霉亲和素-PE。用箔纸密封板，并在设定转速为 800 ± 50 rpm 的摇床上，室温孵育 30 分钟。
8. 如步骤 4 所述重复清洗。
9. 每孔加入 100 μL洗涤缓冲液重悬微珠。在设定转速为 800 ± 50 rpm 的摇床上孵育 2 分钟。
10. 在 90 分钟内使用 Luminex®分析仪读取结果。
❖实验指南：
❖讲座：
没有仪器平台，害怕操作失误？不用担心，您只需提供样本，乐备实Labex帮您一站式全搞定，目前多款细胞因子检测服务正在大促中，点此查看详情 。
Cytometric Bead Array（CBA）
与前述Luminex技术类似，CBA也是基于微球的检测方法。不同的是CBA实现多个因子同时检测是利用了流式细胞仪可以识别同一种荧光素不同强度的特点。
将每种微球表面包被特定细胞因子的捕获抗体，通过流式细胞仪对微球和检测抗体上PE的荧光的强度进行分析，从而可以同时定量检测30种分析物。
❖仪器平台：流式细胞仪
❖反应容器：流式管
❖单管检测指标数：1~30
❖样本种属：人、小鼠、大鼠、狒狒、猕猴、恒河猴、牛、猪
❖可检测样本类型：血浆、血清、培养上清、泪液、体液、鼻腔冲洗液、细胞裂解液等液态样本
样本体积：25-50μL
❖灵敏度：常规10 pg/mL，高敏系列0.274pg/mL
❖线性范围：3-4 logs
❖实验步骤：
图：CBA的检测原理与实验流程
❖实验指南
❖相关讲座
抗体芯片
抗体芯片是检测蛋白的一种技术，包括双抗体夹心检测和直接检测两种形式。膜芯片通常是半定量的，采用化学发光或荧光检测，实验操作类似Western Blot，但不需电泳和转膜步骤。玻璃芯片通常是定量的，使用荧光检测。抗体芯片可同时检测多达1,200 种人类蛋白、640 种小鼠蛋白或 67 种大鼠蛋白，主要用于信号转导、蛋白质组学、肿瘤及其他疾病的相关研究。抗体芯片单次实验检测的样本数量较少，以R&D公司的Proteome Profiler系列产品为例，一个试剂盒检测4个样品，更适合做样品数量较少的多指标筛选。
❖仪器平台：膜芯片用化学发光仪，玻璃芯片需用玻璃芯片扫描仪
❖反应容器：膜或玻璃芯片
❖单张芯片可定量检测指标数：人类蛋白≤1200，小鼠蛋白≤640，大鼠蛋白≤67
❖检测种属：人、小鼠、大鼠、猪、牛、马、犬、兔、绵羊、猫、恒河猴、鸡、海豚
❖可检测样本：细胞培养上清、细胞组织裂解液、血清、血浆等
❖样本体积：定量芯片50-100ul
❖灵敏度：~pg/ml
❖实验指南：
❖相关讲座：
超灵敏多指标检测技术
电化学发光检测技术Meso-scale Discovery (MSD)
MSD超敏电化学发光技术由美国Meso Scale Discovery公司研发。 与传统的ELISA相似，MSD也是通过双抗体夹心法来定量目标蛋白。但其独特之处在于其采用了石墨烯材质的电极板作为反应容器，这种材质能显著增加捕获抗体的固载量。同时利用SULFO-TAG（三联吡啶钌）替代传统的酶或荧光染料标记在检测抗体上，当电极板通电时，SULFO-TAG发生一系列氧化还原反应，产生光信号，随后被仪器内的CCD相机捕获。MSD是电化学和化学发光两个过程的完美结合，可将许多非特异信号予以排除，受样本性质的影响更小，对于各类生物学样本的兼容度高。
图：MSD检测原理
MSD的一大特点是超高的灵敏度及更宽的线性范围，它的灵敏度之所以可达到飞克级别，主要原因有以下几个方面：
1、石墨烯底板：其单位面积的抗体包被量较常规材质孔板提高约10倍
2、电化学发光技术：
MSD 以SULFO-TAG（三联吡啶钌) 作为发光基质，其分子量约为1000Da（约为HRP的1/40），空间位阻小，易于标记抗体，且不易阻碍其与待测物质的结合；当电极板通电时，三联吡啶钌上的钌元素会发生一系列氧化还原反应，循环反应持续进行并释放出光子，该光信号在620nm处发射，较荧光更稳定，不易淬灭；
3、包被方式：S-PLEX试剂盒孔板包被的是链霉亲和素，将其与生物素抗体结合。由于链霉亲和素与生物素有极高的亲和性，一个链霉亲和素可同时结合四个生物素分子，使得抗体包被量被大大提高。
目前，MSD技术在免疫学、疾病研究和药物开发等多个领域均得到了广泛应用。特别是在神经退行性疾病的研究中，MSD已成为aβ 38、40、42等蛋白检测的金标准，仅需10微升的样本量即可定量检测这些分析物。此外，MSD还提供了包括α-Synuclein、APP、NFL、NFH、Tau（total）、VEGF-A、GFAP以及不同磷酸化位点的Tau（如pT181、pT231、pT217）等在内的多种神经相关指标的检测产品，为科研人员提供了有力的研究工具。
❖检测仪器平台：MSD S120/MSD S600
❖反应容器：石墨烯材质的96或384孔电极板
❖单孔可检测指标数：1-10
❖检测种属：人、小鼠、大鼠、非人灵长类、犬
❖可检测样本类型：血清、血浆、脑脊液、尿液、细胞上清、组织裂解液、乳汁、唾液、房水、支气管肺泡灌洗液等多种样本
❖所需样本体积：10-25μL
❖灵敏度：可达fg/ml
❖线性范围：3–6 logs，线性范围更宽
❖实验步骤：
1.清洗并加入样品
用至少150ul/孔的洗涤缓冲液清洗酶标板三次。
每孔加入50 ul准备好的样品、校准品或对照品。
用粘性封板膜密封酶标板，并在室温下摇动孵育2小时。
2.清洗并加入检测抗体溶液
用至少150 ul /孔的洗涤缓冲液清洗酶标板三次。
每孔加入25 ul检测抗体溶液。用粘性封板膜密封酶标板，并在室温下摇动孵育2小时。
3.清洗并读数
用至少150 ul /孔的洗涤缓冲液清洗酶标板三次。
每孔加入150 ul的2X读数缓冲液T。
使用MSD仪器分析酶标板。
❖应用：
1. 神经退行性疾病、内分泌疾病、肿瘤免疫治疗等研究
2. Biomarker筛选
3. 药物免疫原性评估、抗体药物筛选、疫苗开发等
❖实验指南：
❖相关文章：
❖相关讲座：
优宁维提供MSD仪器、试剂及服务，多款MSD检测服务正在大促中，点此查看详情 。
邻近延伸分析
（Proximity Extension Assay，PEA）
PEA使用一对与目标蛋白特异性结合的抗体，每个抗体都连接有一个独特的DNA序列。当两个抗体与目标蛋白质结合时，它们的DNA序列会靠近，通过DNA聚合酶催化进行延伸和扩增，最终通过实时定量PCR（qPCR）或二代测序（NGS）检测DNA信号，实现对目的蛋白的分析。PEA已被Olink®公司商业化，提供Explore HT（5300个指标）、Explore（384/3072个指标）、Target（48/96个指标）、Flex（半定制）、Focus（定制）系列试剂盒，一周最高可检测2064个样本，其中Target48/Flex/Focus系列可提供定量结果（pg/ml），其他则可提供相对定量的NPX值（Normalized Protein eXpression，均一化蛋白表达）。Olink®技术以其多指标、高通量、极微量样本及超高灵敏度的优势，在生物标志物发现、疾病机理研究、药物开发、临床诊断和人群健康研究等领域展现了广泛的应用前景。
❖检测平台：Olink® Signature Q100或二代测序仪
❖反应容器：96孔板
❖单孔检测指标：48~5400+
❖可检测种属：人、小鼠
❖可检测样本：血浆，血清，组织裂解液、细胞培养液、脑脊液、尿液、房水等多种体液样本
❖所需样本量：1-6ul
❖灵敏度：fg/ml
❖线性范围：10 logs，fg-mg/mL