- 移动端
上海乐备实生物技术有限公司品牌商
6 年
手机商铺
- NaN
- 0
- 0
- 2
- 2
推荐产品
技术资料/正文
细胞因子检测全解析，这13个宝藏技术你必须知道-（上）
428 人阅读发布时间：2025-06-19 14:36
细胞因子是一类分泌型的小分子蛋白（肽），其分子量在6-70 kDa之间1，包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子2，它们在细胞信号传导、细胞间通讯及多种细胞和免疫功能中发挥关键作用，并参与炎症反应的调节，细胞生长与分化、趋化及促血管生成3。
细胞因子的产生受到严格调控。由于大多数细胞因子具有较高生物活性，它们在体液中的稳态浓度较低。在健康个体中，细胞因子在体液或组织中可能检测不到，或者以pg/mL 浓度存在1。细胞因子浓度升高可能表明与炎症或疾病进展相关的通路被激活4，因此常被用作生物标志物，用于了解和预测疾病进展及监测治疗效果。细胞因子的检测对于疾病研究和临床应用至关重要。
本文旨在介绍目前常用的细胞因子检测技术，包括：
❖单指标检测技术：ELISA，WB，TR-FRET
❖多指标检测技术：Luminex、CBA、抗体芯片
❖超灵敏多指标检测技术：MSD、PEA、Simoa®
❖单细胞水平的细胞因子检测：ELISpot、流式细胞术、质谱流式
❖质谱检测技术
❖常用细胞因子检测方法比较
🔔提示：由于干货较多,篇幅较长,阅读大约需15分钟,建议先在看哦！下拉到文末，有科研互动交流通道等你前往~
常见免疫检测原理
细胞因子检测/定量常依赖于免疫检测。免疫检测利用抗体的高特异性识别来检测目的蛋白。常见免疫检测的灵敏度通常在1-100 pg/mL之间，检测原理为双抗体夹心法或直接法。
（A）双抗体夹心法：使用一对配对的捕获抗体和检测抗体。捕获抗体固定在如96孔板、微珠、玻璃或膜等固相载体上。检测抗体与酶、荧光标签或DNA标签偶联，通过机器检测其信号，实现对细胞因子的定量；
（B）直接法：将捕获抗体固定在载体上，对分析样本中的蛋白质进行荧光标记，与抗体孵育。
图：常见免疫检测的原理
免疫检测对细胞因子的定量通常由标准曲线计算得出，标准曲线由数个已知浓度标准品测得的信号值绘制，以此推算未知样本的浓度。
在免疫检测中，样品成分（如其他蛋白质、离子、盐、pH 值或样品粘度）会对抗体表位的可及性、抗体与抗原的特异性/非特异性结合产生强烈影响，被称为基质效应。尽可能地减少基质效应是降低背景和准确定量的前提，可采用的方法是使标准品的基质组成与样本背景相似，或对样品进行稀释等。此外，检测应设置合适的对照，例如阴性对照、阳性对照、质控品（已测量的样品）等，以保证结果的准确性3。
备注：
1. 下文列出的种属、样本类型、灵敏度、线性范围及实验步骤等信息仅供参考，具体信息请查看试剂盒说明书
2. 标注乐备实可提供检测服务的技术，乐备实均可提供全套实验服务，包含样本处理、实验操作、上机检测、数据分析等。上海乐备实生物技术有限公司，简称乐备实(LabEx)，是主要专注于提供多组学/多因子相关检测分析的实验服务专家，具备全面的一站式生物标志物发现平台。已经为超过3500个客户提供服务，目前年检测样本超过30万，受到广大客户的赞赏。
单指标检测技术
酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)
ELISA是基础和临床研究中对单一分析物进行定量分析的重要技术，可广泛用于多个物种和靶标的检测。目前商用的细胞因子ELISA试剂盒大多采用双抗体夹心法，能够高特异性检测复杂样品中的分析物，灵敏度高，操作简单方便，成本相对较低。但ELISA一次实验仅能检测一个靶标，若需在同一样品中检测多个靶标，操作多个ELISA较为复杂，时间花费长，且需要的样本量较大，后面提到的多指标分析技术可克服这些问题。另外，ELISA较窄的动态范围，使得部分样本需要稀释，这样可能会夸大样本间的差异7。
❖检测仪器平台：酶标仪
❖反应容器：96或384孔板
❖可检测种属：人、小鼠、大鼠、非人灵长类、猪、狗、牛、羊等多个种属
❖可检测样本类型：血清、血浆、细胞培养上清等，不同的试剂盒适配的样本类型不同。
❖所需样本体积：50-100 µL
❖单次实验可检测指标数：1
❖灵敏度：pg/ml
❖检测仪器平台：酶标仪
❖线性范围：2-3 logs，常规ELISA线性范围在10pg/ml-1000pg/ml，超敏试剂盒则为0.5-10pg/ml，不同试剂盒线性范围不同。
❖实验步骤
传统ELISA
即用型ELISA详细操作步骤，以Mouse IL-1β ELISA Kit（abs520034-96T）为例
1. 准备好所有需要的试剂和标准品；
2. 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4. 分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封
5. 住反应孔，室温孵育2小时;
6. 将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然
7. 后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。
8. 在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；
9. 重复第5步洗板操作；
10. 在每个微孔内加入100uL SA-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；
11. 重复第5步洗板操作；
12. 在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30分钟，注意避光；
13. 在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。
14. 加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。
15. 计算结果
非即用型ELISA需自行将捕获抗体固定在孔板上，以下为抗体包被的详细步骤，以Human IL-6 DuoSet ELISA（DY206-05）为例
1. 将捕获抗体用不含载体蛋白的PBS稀释至工作浓度。每孔加入100 μL稀释后的捕获抗体，进行包被，密封后在室温下孵育过夜。
2. 每孔吸弃液体并用洗涤缓冲液清洗，重复此过程两次，总共洗涤三次。使用喷瓶、歧管分配器或自动洗板机将洗涤缓冲液 (400 μL) 注入每孔中进行清洗。每一步需完全去除液体。最后一次洗涤后，吸弃或倒置微孔板并在干净的纸巾上轻拍，去除剩余的洗涤缓冲液。
3. 每孔加入300 μL试剂稀释液来封闭孔板。室温下孵育至少1小时。
4. 重复第2步的吸弃/洗涤操作。
一步法ELISA
传统ELISA通常采用聚苯乙烯板，其疏水特性能够与蛋白质进行非特异性结合，使蛋白质能够附着在其表面，从而固定捕获抗体。然而，传统的ELISA方法需要多次洗涤，操作时间（3-5小时）相对较长，而且多次清洗和孵育可能会导致分析物脱落5。
亲和肽标签PS19（RAFIASRRIKRP）对亲水性聚苯乙烯表面有特异性亲和力，将此标签与谷胱甘肽S-转移酶（GST）进行基因融合后，可以被优先固定在亲水性聚苯乙烯（phi-PS）板上，而不会受到共存蛋白质分子的干扰5。另外，兔IgG与KPS19R10肽化学偶联后，也表现出较强的亲和力5。
基于这些发现，研究人员开发了一种使用带有肽标签的phi-PS板和连接蛋白作为配体蛋白的一步法ELISA5。这种方法避免了传统疏水性聚苯乙烯板（pho-PS）带来的非特异性结合问题，可以减少洗涤和孵育步骤，避免了因清洗导致的分析物脱落。与传统ELISA相比，一步法ELISA不仅显著缩短了操作时间，还保持了高灵敏度。
优宁维已上线多款OneStep ELISA试剂盒，仅需60分钟即可完成实验，包括IL-2/IL-6/IL-13/IFN-γ等指标，指标持续更新中，点此可查询。
实验步骤：
图：OneStep ELISA操作步骤简要示意图
OneStep ELISA详细操作步骤，以 Human IL-2 OneStep ELISA Kit（abs551116-96T）为例
1. 使用前将需要所有材料和试剂平衡至室温。建议所有标准品、对照品和样品一式两份做平行孔测试。
2. 准备所有试剂、工作标准品和样品。
3. 从可拆卸的板框上去除多余的酶标板条，将其放回含有干燥剂包装的箔袋中，重新密封并返回2-8ºC储存。
4. 取50μL样品或标准品加到相应的孔中。
5. 每孔中加入50μL抗体对混合液.
6. 贴上封板膜，在设置条件为“转速500转/分钟和温度37°C”的 酶标板恒温振荡器上孵育45分钟。
7. 用300μL 1X Wash Buffer清洗每个孔，清洗三次。最后一次洗涤后，把板子倒过来，在干净的纸巾上轻轻拍打数次，以去除多余的液体。
8. 每孔加入100μL TMB底物，在500转/分的酶标板恒温振荡器上避光显色10分钟。
9. 每孔加入100μL终止液，充分混匀后在30分钟内测定每个孔的OD450，使用设置为450nm的酶标仪。
10. 结果计算
❖技术文章：
❖讲座：
细胞因子热门靶标ELISA正在超值买赠中，买4免1、买10免3、买20免8，点击此处可查看详情。
蛋白质免疫印迹法(Western Blot, WB)
ELISA常用于检测液体中的细胞因子，而WB更适用于分析细胞内以及复杂生物样本和组织中的细胞因子。在WB实验中，变性蛋白首先在聚丙烯酰胺凝胶中分离，随后被转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜上，通过特异性抗体进行检测。虽然WB在检测细胞因子时可能不如 ELISA 灵敏，但它可提供蛋白质分子量信息，可区分剪接体或检测细胞因子分子降解，也可区分无活性前体和活性形式，或者是检测蛋白质的磷酸化等各种翻译后修饰。在检测前进行亚细胞组分分离（如核质分离、线粒体提取等），还可分析靶蛋白在细胞内的定位情况。
图：WB检测原理
❖检测平台：化学发光仪或荧光成像分析仪
❖反应场所：NC膜或PVDF膜
❖单个样本检测指标：1
❖可检测样本：细胞或组织裂解液
❖所需样本量：10-150ug 总蛋白
❖灵敏度：pg~ng
❖数量级：无标准曲线，不可定量
❖实验步骤
一、样本准备
1. 裂解提取组织或细胞中的蛋白，并且测定蛋白纯度和浓度；
2. 蛋白溶液中加入适量蛋白上样缓冲液，置于沸水/金属浴中加热5-10min，后转移到冰上或者 4°C冰箱待用，短期可以保存于-20°C，长期请保存于-80'C。
二、SDS-PAGE胶的制备
3. 清洗玻璃板、梳子、制胶板和烧杯，晾干后装备好制胶板;
4. 根据目的蛋白的大小按配方配制不同浓度的分离胶，以10ml10%的分离胶为例：先依次加入4.6mlH20、2.7ml30% Acrylamide、2.5 ml1.5M Tris-Hcl(pH8.8)和0.1ml10% SDS，再加入 0.1ml 10%过硫酸铵和0.006mI TEMED立即混匀后倒入模具中，加入约1cm蒸馏水封顶；
5. 室温下30-60min待胶凝固后，倒去蒸馏水。按配方配制5%浓缩胶，以5ml为例：先依次加入3.4 ml H20、0.83ml 30% Acrylamide、0.63ml1.5M Tris-Hcl(pH6.8)和0.04ml 10% SDS,再加入0.04m10%过硫酸铵和0.005mI TEMED，混匀后立即倒入模具中，垂直插上梳子，注意不要有气泡。
三、电泳
6. 室温 30min 待胶凝固好后,将玻璃板固定在电泳桥中放入电泳槽，加入提前配制好的电泳液后，拔去梳子开始上样，选用相应蛋白分子量的 Marker，每个孔加入适量样品，在旁边空余的孔内加入适量蛋白Marker；
7. 电压调至80V，恒压状态开始电泳,约30min左右当 Marker条带分开后调整电压至 120V,继续电泳,直到指示剂溴酚蓝跑到凝胶最下端时，停止电泳。
四、转膜
8. 准备 PVDF 膜裁剪成合适大小并做好标记，提前配置好 1X 快速转膜缓冲液并预冷;
9. 用甲醇或者 PVDF 膜浸润激活液浸泡活化 PVDF 膜 30-60s
10. 电泳结束后，按顺序搭载转膜装置,将胶平整铺在电转夹上，将激活的PVDF膜覆盖于胶上,保证胶和膜之间没有气泡。缓慢加入预冷的1X快速转膜缓冲液,将转膜夹固定好后放入电转仪中,将电泳仪至于冰水混合物中,并且电泳仪内部需加入冰袋;
11. 电流 200-250mA，恒流状态,根据分子量大小设置转膜时间,开始电转。
五、封闭
12. 转膜结束后,先放入TBST漂洗一遍,去除膜表面的转膜液。再将PVDF膜转移到膜盒中，加入快速封闭液，室温轻摇15-30min(或使用5%脱脂奶粉溶液封闭 1h)。
六、免疫检测
13. 倒去封闭液，TBST在摇床上快速清洗三次,10 min/次。加入稀释好的一抗,室温摇床慢速孵育 2 小时或者 4°C过夜；
14. TBST快速清洗三次，10min/次。加入稀释好的二抗,室温摇床慢速摇晃孵育 1-2 h;
15. 弃去二抗，TBST 快速清洗三次，10min/次。
七、显影
16. 将显影液 A和 B等比例混合配成工作液(现配现用)；
17. 把PVDF膜放在水平桌面上的保鲜膜上，在膜表面加入工作液，并使工作液完全覆 PVDF 膜,反应30-60s;
18. 取出PVDF膜，吸干多余的液体，放入化学发光仪中进行蛋白显影分析。
点此可查看WB成功指南，包括实验详细步骤，操作视频、实验小技巧及疑难解答等。
❖
相关讲座：
爱必信WB辅助试剂满5赠礼大促中，点此查看详情。
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
TR-FRET 是一种将时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)和荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）相结合的技术。
图：THUNDERTM TR-FRET技术原理图
在FRET中，不同生物分子分别被标记上供体或受体荧光团。当生物分子相互作用时，供体和受体荧光基团靠近。此时，当供体被激发后，它可以将其发射能量转移给受体，受体进而发射特定波长的荧光。供体和受体的荧光发射波长不同，可通过仪器检测，从而实现对生物分子相互作用的定量分析。铕-藻蓝蛋白（Eu-APC 或 Eu-XL665）和铽-PE（Tb-PE）是两种常见的供体-受体对。Eu 的峰值激发/发射在 340/615 nm，而 APC 的峰值激发/发射在 615/660 nm。
图：FRET原理
时间分辨荧光（TRF）通过使用长寿命荧光的镧系元素荧光团来降低背景信号。这种长寿命荧光持续数毫秒，因此，通过脉冲光源（例如闪光灯）激发荧光基团后，延迟一段时间再进行信号测量（即“计数窗口”），可以使仅存续纳秒的短寿命的荧光衰减后再进行测量。时间分辨荧光（TRF）能够显著提高信噪比。最常使用的镧系元素包括铕、铽和钐。这些元素通常以螯合物或笼状化合物的形式应用，以确保良好的信号强度和稳定性。
图：TRF原理
TR-FRET 通常用于分析分子间的相互作用，在检测细胞因子时，供体和受体通常是能识别同一个细胞因子不同抗原表位的抗体对。一种抗体用供体荧光团（铕穴合物）标记，而另一种抗体用受体荧光团（APC、ULight 或 d2）标记。它们特异性地与分析物结合，但结合位点不同，从而使供体和受体荧光集团靠近，实现 FRET2。
TR-FRET的时间分辨特性和近距离激发信号可以排除样本内其他成分的背景荧光，使其成为无需清洗的均相检测方法。其数据分析采用的是受体/供体荧光的比值，可进一步减少非特异性信号。由于以上种种优点，TR-FRET已广泛应用于药物研发，包括高通量筛选。
不过，由于TR-FRET涉及三个基本成分（供体、分析物和受体）之间的复杂物理特性，这三种成分的浓度和比例会显著影响信号，实验需要进行大量优化。FRET要求的近距离（20-90 Å）也给寻找合适的供体-受体对带来挑战2。
❖仪器平台：安装有TR-FRET模块的酶标仪
❖反应容器：96 、384 或 1536 孔板，推荐使用浅孔板
❖检测样本种属：人、小鼠、大鼠、猪
❖可检测样本类型：细胞培养上清、血清
❖样本体积：样本体积15ul，整个反应体系仅20ul
❖灵敏度：pg/ml
❖线性范围：4 logs
❖特点：
1. 操作简单、快速：均相检测技术，无需洗板和包被，只需两步加样即检测，1-2h快速检测；
2. 反复读板，信号稳定：实验体系可支持反复读值，过夜、48h后读值亦可；
3. 节省样本：实验体系为20μl，样本仅需15μl；
4. 超高通量：兼容94孔，384孔和1536孔微孔板。
❖实验步骤：
详细操作步骤，以THUNDER™mouse IFNγ assay（KIT-MIFNG-100）为例
1. 准备缓冲液、标准品、样品及抗体等
2. 向孔板中添加15 µL标准品工作液或 15 µL 细胞上清液样品
3. 向每个检测孔中添加 5 μL 4X 抗体检测混合物 (Eu-Ab1 + FR-Ab2)
4. 密封膜盖住孔板，室温孵育 1 小时
5. 轻轻取下密封膜，在兼容TR-FRET 的微孔板读数仪上读取数据
优宁维提供多款TR-FRET试剂盒，助力药物研发，点此查看详情 。