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技术资料/正文
细胞因子检测全解析，这13个宝藏技术你必须知道-（下）
152 人阅读发布时间：2025-06-19 14:40
单分子阵列
（Single Molecular Array，Simoa®）
Simoa®技术是一种用于检测极低浓度蛋白质的高灵敏度技术。它将样本中的目的蛋白捕获到含有特异性抗体的微珠（直径2.7μm）上，并将这些微珠分布在微流控芯片中的238000个小孔（nanowell）内。每个小孔体积非常小，直径仅4.5μm，体积约 40 fl 左右。将免疫复合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率荧光显微镜对荧光点进行计数，依据泊松分布理论，计算同时含珠子与荧光产物孔的数量/含珠子孔总数的比值，以此确定样品中的蛋白质浓度。Simoa® 的整个实验流程（包括样本稀释，试剂添加，孵育，洗涤，检测和分析等所有环节）均由专用仪器平台完成，降低了手工操作的误差，单次实验最多可检测10 个指标，比传统ELISA灵敏度提高1000倍以上，检测限低至1 fg/mL6。目前，Simoa®广泛应用在神经性疾病、肿瘤检测、传染性疾病等研究中。
❖实验平台：Simoa专用仪器
❖反应容器：96孔板或样本管
❖单次实验检测指标：≤10个
❖可检测种属：人、小鼠、大鼠、非人灵长类、牛、猪
❖可检测样本：血浆，血清，脑脊液、眼泪、细胞培养上清等多种生物样本
❖所需样本量：1ul-100 ul，平均25 ul
❖灵敏度：fg/ml
❖线性范围：2.5~4+ logs
单细胞水平的细胞因子检测
酶联免疫斑点实验(Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISpot)
常见的免疫检测方法通常仅可检测由大量细胞产生、释放到组织或各类体液中的细胞因子，或是体外培养细胞释放的细胞因子，测得的是细胞的平均反应，无法检测某类细胞亚群（如抗原特异性 T 细胞或 B 细胞）的细胞因子分泌情况。ELISpot则可以在单细胞水平对抗体分泌细胞(ASC)及细胞因子分泌细胞进行检测。首先，将细胞孵育在包被有捕获抗体的多孔板上，该抗体可捕获分泌的细胞因子。去除细胞后，加入检测抗体，通过显色反应或荧光观察细胞因子的产生。每个产生细胞因子的细胞位置都显示为一个斑点。通过 ELISpot读板仪对斑点进行计数和分析。统计膜上的斑点数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，即可以计算出阳性细胞的百分比。
目前，ELISpot的主要应用在以下领域：
1. 免疫学基础研究（T 细胞和 B 细胞，Th0/Th1/Th2 细胞分析）：ELISpot可用来区分被激活的不同T细胞亚群。例如Th1细胞主要分泌IFN-γ,IL-2 和TNF-α，而Th2细胞分泌IL-4,IL-5和IL-13等。
2. 疫苗研究：ELISpot是检测和评价疫苗的细胞免疫水平的国际公认的标准工具，已广泛用于疫苗的研制和评估。
3. 肿瘤免疫研究和免疫治疗/细胞治疗：用于检测肿瘤抗原特异性的细胞免疫反应。
4. 感染性疾病研究与诊断：第一个被SFDA 批准的基于ELISpot法的诊断平台（T-SPOT.TB）已上市，此外，ELISpot还可用于其他感染性疾病如HBV,HCV等的抗感染免疫研究与诊断。
5. 自身免疫疾病研究：如I型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等疾病病因分析、预测、早期诊断、指导治疗以及预后分析等。
6. 其他：药物筛选、移植免疫研究等，适用于任何想要在单细胞水平研究蛋白分泌的实验。
❖检测平台：ELISpot Reader
❖反应容器：ELISpot 多孔板（通常是96孔板）
❖单次实验检测指标：ELISpot检测单个指标，FluoroSpot最高可测7种
❖可检测样本：人或动物的PBMC、脾细胞、其他类型的免疫细胞，如T细胞、B细胞等
❖灵敏度：1 in 100,000 cells
❖实验步骤：以Mouse IFN-gamma ELISpot Kit（EL485）为例
1. 在每孔中加入用200 μL无菌培养基，室温孵育20分钟。
2. 吸出孔内的培养基，立即向每孔中加入100 μL相应的细胞或对照。
3. 在湿润的37°C二氧化碳培养箱中孵育细胞。每个刺激的最佳孵育时间应由研究者确定。在孵育期间不要扰动细胞。
4. 吸出每个孔中的液体并清洗，整个过程重复三次共四次清洗。使用挤压瓶、歧管分配器或自动洗板机向每孔中加入250-300 μL的洗涤缓冲液进行清洗。最后一次清洗后，移除剩余的洗涤缓冲液。将板倒置并在干净的纸巾上轻拍。
5. 每孔中加入100 μL稀释的检测抗体混合物，2-8°C过夜孵育。或在摇床上室温孵育2小时。
6. 重复步骤4中的清洗程序。
7. 每孔中加入100 μL稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶浓缩液A，室温孵育2小时。
8. 重复步骤4中的清洗程序。
9. 向每个孔中加入100 μL的BCIP/NBT底物，室温避光孵育1小时。
10. 去除孔板中的BCIP/NBT底物溶液，用去离子水冲洗微孔板。将微孔板倒置轻敲以去除多余水分。从微孔板底部移除柔性塑料排水装置，用纸巾彻底擦干板底并完全晾干（室温下60-90分钟或37°C下15-30分钟）。
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❖相关讲座：
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流式细胞术
（Flow Cytometry,FCM）
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在生物医学研究中广泛应用的技术，它通过测量细胞的物理和化学特性来对细胞进行快速、高通量的分析和分选。基于单细胞分析，可检测表达细胞因子的细胞的频率，并通过对细胞内细胞因子和细胞标记物进行染色来表征特定细胞群。流式细胞术能进行多参数分析，分析参数的数量与细胞群、目标细胞因子和流式细胞仪相关。但并非所有细胞因子都能通过单一方案检测到，检测低表达或新鉴定的细胞因子可能需要对染色进行严格优化。此外，细胞内存在细胞因子并不一定意味着它会从细胞中释放出来或在体内表现出生物学效应3。
❖检查平台：BD FACS Celesta等流式检测平台
❖样本类型：心脏、肝、肺、脾、肿瘤、肠、皮肤、血液等样本
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流式实验操作步骤，点此查看
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质谱流式细胞术
（Mass cytometry，CyTOF）
质谱流式细胞术（也称为CyTOF）是一种将流式细胞术和质谱法相结合的单细胞分析技术。该方法理论上每秒可对多达3000个细胞进行实时定量单细胞分析，并可以同时测量一个细胞中的60种不同标记物（蛋白质或其他生物分子）。与传统流式细胞术一样，细胞被特异性抗体染色，但这些抗体与元素标签（金属的稳定同位素）而不是荧光染料结合。细胞分析由电感耦合等离子体飞行时间质谱仪（ICPTOF-MS）进行。与基于荧光的流式细胞术相比，该技术的主要优势是分辨率高、灵敏度高，可以同时测量大量标记物，而且不需要补偿发射光谱重叠。然而，该技术无法进行细胞分选，而且结果的质量控制和统计分析也具有挑战性3。
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质谱(Mass spectrometry,MS)
质谱（MS）是蛋白质组学的一项基本技术，用于蛋白质的鉴定和定量。在经典的自下而上的蛋白质组学工作流程中，蛋白质先被分离并用酶（如胰蛋白酶）消化成肽段，之后肽段经过浓缩、脱盐、高效液相色谱（HPLC）分离，再通过质谱分析。串联质谱（MS/MS）测量肽段的质荷比及其片段离子，实现对肽段/蛋白质进行特异性的鉴定和定量。
然而，质谱在细胞因子检测中面临若干挑战。首先，质谱仅能检测带电荷的肽，而不同肽的离子化效率存在差异。其次，细胞因子等低分子量蛋白质产生的肽段少，并且在复杂的生物样本中含量极低，因此在没有适当的富集步骤下难以检测。此外，尽管质谱技术具有高重复性和特异性，但由于其对低丰度蛋白质如细胞因子的检测灵敏度有限，通常需要样品预处理。蛋白质鉴定过程依赖于现有数据库，这在非人类物种的研究中可能不够全面。总的来说，与免疫学方法相比，质谱技术在灵敏度上可能有所不足3。
常用细胞因子检测方法比较
细胞因子的检测方法众多，每种方法各有优劣势，科研人员需根据样本种属、指标、样本体积、数量、仪器平台及价格等挑选适合的技术，也可联系小优为您推荐合适的方案。优宁维提供完整的细胞因子检测解决方案，包含仪器、试剂耗材及服务，为您的科研保驾护航。
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相关文献:
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