衰老及阿尔茨海默病中前额叶皮层的立体空间转录组测序研究

文献摘要：

阿尔茨海默病（AD）是老龄化社会中最常见的痴呆类型，其病理机制复杂且与正常衰老的界限模糊，给临床诊疗带来巨大挑战。前额叶皮层（PFC）是 AD 病理损伤的核心脑区，传统研究手段难以同步捕获其分子表达特征与空间分布信息。本研究采用亚细胞分辨率的 Stereo-seq 技术，构建 AD 患者与年龄匹配对照者 PFC 的空间转录组图谱，系统解析皮层分层结构紊乱、细胞类型特异性转录变化及细胞间通讯异常，筛选出关键调控因子与神经保护模块，为区分 AD 与正常衰老、开发新型治疗靶点提供突破性见解。

实验结果：

1、PFC 空间转录组图谱构建与皮层分层鉴定

本研究纳入 6 例男性 AD 患者及 6 例年龄匹配男性对照，统一采集前额叶皮层 BA10 区组织样本，建立标准化研究队列（图 1A）。免疫组织化学（IHC）染色明确病理差异：正常衰老（NA）组（B01809A3）几乎无 Aβ 斑块沉积，中度 AD 组（B01809C2）可见少量红色 Aβ 斑块，重度 AD 组（A02092E1）则表现为大量 Aβ 斑块聚集；无监督聚类结果与 H&E 染色组织学结构高度吻合，验证了分层鉴定的可靠性（图 1B）。UMAP 可视化分析清晰呈现 7 个聚类（L1-L6 + 白质 WM），直观反映不同皮层分层及白质区域的转录组差异特征（图 1C）。富集基因表达热图进一步量化各聚类的分子表达水平，为后续分层特异性分析奠定核心数据基础（图 1D）。本研究不仅验证了 AQP4（L1 层）、HPCAL1（L2/3 层）、PCP4（L5 层）等经典皮层分层标志物的空间表达模式，还新挖掘出 MT-RNR2（L1 层）、TMEM59L（L2/3 层）等未报道的层特异性标志物，丰富了 PFC 皮层分层的分子标识体系（图 1E、1F）

2、AD 进展中皮层分层结构紊乱与区域特异性转录异常

 

3、单细胞分辨率下高应激神经元的定位与特征鉴定

细胞通讯分析发现，AD 患者细胞间相互作用数量随病情进展持续减少，由正常衰老组的 3571 个降至重度 AD 组的 2244 个，直观呈现神经网络连接逐步崩溃的动态过程（图 3A）。热图对比结果显示，L4-L5 层间相互作用及 L4-L6 层信号输出显著减少；此类垂直网络是维持认知功能的核心结构，其破坏或直接诱发认知损伤（图 3B）。关键神经递质信号通路的损伤尤为显著：L5 层（主要输出层）向其他皮层分层传导的 SLC1A2-GRIA2（谷氨酸信号通路）、NRXN3-CLSTN1（突触分化相关）等核心配体 - 受体互作，在中度 AD 组显著减弱，至重度 AD 组则完全消失，这为认知衰退的分子机制提供了直接实验依据（图 3C）。

 

4、单细胞分辨率下高应激神经元的定位与特征鉴定

在 bin50 分辨率下，本研究注释出星形胶质细胞（Ast）、兴奋性神经元（Ex）等 7 类核心细胞类型，并明确 Ex 主要分布于新皮质、少突胶质细胞（Oli）富集于白质的空间分布特征（图 4A-C）。以线粒体基因占比≥15% 为判定阈值，研究鉴定出高应激 Ex 亚群：该亚群在重度 AD 组占比高达 75.28%，而正常衰老组仅为 0.13%，这一显著差异提示 AD 晚期神经元应激状态呈广泛性激活（图 4F）。高应激 Ex 所在区域同步高表达星形胶质细胞标志物GFAP、AQP4（校正后P值均为 0.0），表明神经元处于高应激状态时，邻近胶质细胞会被激活并向受损区域迁移，进而发挥潜在支持作用（图 4G）。差异基因分析进一步揭示高应激神经元的分子特征：MT-RNR2等线粒体相关基因表达上调，而ENC1、CALM2等神经保护基因表达显著下调（图 4G）。

 

5、单细胞核水平的空间特异性转录应答与代偿机制

本研究首先对所有细胞核进行聚类分析（图 5A），并通过标记基因将其注释为兴奋性神经元、星形胶质细胞等主要细胞类型（图 5B），其空间分布与解剖结构高度一致（图 5C）。为解析细胞对 “高应激焦点” 的应答模式，研究以该焦点为中心，将周边细胞核按距离划分为三个同心圆层级（Level I 距离最近，Level III 距离最远）（图 5D），并基于此分组开展针对性分析。组内比较结果显示，正常衰老（NA）组中，紧邻应激焦点的神经元会特异性上调神经保护基因；而重度 AD 组中该调控模式完全消失，转而呈现热休克蛋白等全局应激基因的普遍性上调（图 5E）。组间比较发现，随着 AD 病情进展，即便处于最靠近应激焦点的前沿区域（Level I），各类细胞中 PSAP 等关键神经保护因子的表达也显著下调，提示其神经保护功能发生衰竭（图 5F）。

 

6、细胞间通讯网络破坏与 Aβ 清除能力下降

细胞间通讯分析显示，正常衰老组 L1 层细胞的配体 - 受体对数量及互作强度显著高于 L3 层，形成高效的保护性细胞互作网络（图 6A-B）。而 AD 组中，PSAP-GPR37L1（神经保护通路）、APP-CD74（Aβ 抑制通路）等核心配体 - 受体互作显著减弱甚至完全消失，直接造成神经保护功能与 Aβ 清除能力的双重受损（图 6C-E）。兴奋性神经元（Ex）与星形胶质细胞、小胶质细胞间的保护性互作，在重度 AD 阶段近乎完全断裂，这或为 Aβ 沉积加剧及神经元退行性降解的重要诱因（图 6D-E）。

 

7、神经保护基因模块鉴定与关键转录因子筛选

通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），本研究在兴奋性神经元（Ex）与抑制性神经元（Inh）中鉴定出 4 个核心基因模块（Ex1、Ex2、Inh1、Inh2），其中 Ex1、Inh1 及 Inh2 模块与 AD 病情进展呈显著负相关（图 7A）。GO 功能富集分析表明，这三个模块共同构成神经保护调控网络：Ex1 模块富集 Aβ 形成负调控、蛋白去磷酸化等功能，Inh1 模块参与突触传递调控及 Aβ 应答过程，Inh2 模块则与 Aβ 清除功能密切相关（图 7D）。转录因子富集分析显示，ZNF460 在上述三个核心模块中的富集程度最高，同时 KLF4、KLF5 等促 AD 进展转录因子亦在模块中富集，揭示了 AD 进展过程中复杂的转录调控机制（图 7E）。其中，ZNF460 作为核心转录调控因子，可能通过调控神经保护基因模块参与 AD 病理进程，为新型治疗靶点的开发提供了重要方向。

 

结论：

本研究依托 Stereo-seq 技术的高分辨率优势，结合明确的样本队列特征，首次在空间维度完整勾勒出 AD 患者前额叶皮层（PFC）的分子病理全景。通过图表对应分析，明确皮层分层结构紊乱、细胞应激水平升高、细胞间通讯网络塌陷及神经保护模块下调，是 AD 病情进展的核心病理特征。本研究不仅精准界定了 AD 与正常衰老的转录组差异，还发现以 ZNF460 为核心的关键调控网络，为解析 AD 发病机制提供了全新视角。这些研究发现将为 AD 早期诊断标志物的研发及精准治疗策略的制定提供重要支撑，为攻克这一神经退行性疾病注入新的希望。

 

 

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