IF20.3！LabEx Luminex平台助力系统性硬化症的自身抗体发现

本周为大家带来的文献为发表Ann Rheum Dis. (IF: 20.3)的” Identification and validation of anti-protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) antibody as a novel biomarker for systemic sclerosis (SSc)”。本文使用了LabEx提供的Luminex检测服务。

   

  

系统性硬化症（SSc）是一种复杂的自身免疫性疾病，表现为自身免疫、血管病变和广泛的组织纤维化。该疾病涉及多种自身抗体的产生，然而，目前仍缺乏能够有效诊断和评估病情的新型生物标志物。近年来，蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）作为一种关键的酶，因其在多种生理和病理过程中起重要作用，逐渐引起了研究者的关注。本研究旨在鉴定和验证抗PRMT5抗体作为SSc的新型生物标志物，以期为SSc的诊断和治疗提供新的思路。

 

实验方法

患者招募和样本收集：招募了90名系统性硬皮病（SSc）患者、30名系统性红斑狼疮（SLE）患者、8名干燥综合征（SjS）患者和84名健康供体。

   

   

实验流程概述：

1. 样本处理：
   • 从SSc患者和健康对照（每组n=3）处获得外周血。
   • 血清与由内皮细胞、成纤维细胞、T细胞和单核细胞的细胞裂解液制备的抗原池共同孵育。
2. 抗原-抗体复合物富集：
   • 使用蛋白A/G富集抗原-抗体复合物。
   • 对复合物进行珠上消化，并通过同位素标签进行标记（iTRAQ）。
3. 定量蛋白组学分析：
   • 对这些富集样本进行定量蛋白组学分析，以揭示患者中存在的过度代表性抗体靶标。
   • 使用自动化深度肽测序和定量（DEEP SEQ）质谱平台分析免疫沉淀（IP）-质谱（MS）数据，发现可能的自身抗体，但需进一步验证以排除非特异性结合。

（B）抗体验证：

1. 样本处理：
   • 从90名SSc患者、30名SLE患者、8名SjS患者和84名健康供体处获得血清进行抗体验证。
2. 抗体检测：
   • 通过ELISA检测血清中的抗-PRMT1、抗-PRMT5、抗-HK1和抗-CD5L抗体。
   • 确定抗-PRMT5为SSc的特异性自身抗体。
   • 通过免疫荧光染色评估SSc皮肤中PRMT5的表达。

（C）抗-PRMT5抗体水平分析：

1. 数据比较：
   • 比较健康对照与SSc患者中抗-PRMT5抗体的水平。
   • 分析抗-PRMT5抗体水平与SSc患者的临床表型的相关性。

（D）动物实验：

1. 小鼠免疫接种：
   • 每两周用重组PRMT5蛋白对小鼠进行皮下注射，共四次。
2. 组织分析：
   • 收集皮肤和肺组织进行病理检查和整体RNA测序（RNA-seq）。
   • 在PRMT5免疫小鼠中发现皮肤和肺部纤维化，模拟了人类SSc样变化。
   • 识别抗-PRMT5抗体为SSc的潜在贡献抗体。

 

   

LabEx提供的Luminex检测服务

使用 Luminex X-MAP 系统定量检测血清中 IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1beta、IL-13、IL 4、IL-8、IL-10 和 IL-12p70 的浓度（LXLBH10-1/LX MultiDTH-10，LabEx Co.）。
  

   

重要发现

通过应用Deep SEQ蛋白组学平台，研究者总共确认了4798个蛋白，并筛选出了238个富集蛋白质。通过WB和蛋白质互作网络，研究者最后确定了四个目标蛋白：PRMT1, PRMT5, HK-1和CD5L。而在SSc患者中进行的验证显示，SSc患者中抗PRMT5抗体显著升高。因此确定了抗PRMT5抗体是治疗SSc的特异性替代生物标记物。这些抗体在区分SSc与健康对照及其他自身免疫疾病（包括系统性红斑狼疮和干燥综合征）方面表现出强大的诊断准确性，其曲线下面积（AUC）范围为0.900到0.988。值得注意的是，31.11%的SSc患者对抗PRMT5抗体呈现血清阳性。

 

之后研究者进一步证明血清中抗PRMT5抗体水平SSc临床特征的相关性。为了明确抗PRMT5抗体的临床意义，研究者比较了具有一系列临床表型的SSc患者的血清抗体水平。

在皮肤纤维化和肺纤维化患者中，抗PRMT5抗体基线水平均有数值上的升高。同时，血清抗体水平和急性时相反应物、IgG和TIMP-1水平都正相关。此外，研究者还发现，在SSc患者中，抗PRMT5抗体水平与IL-6、肿瘤坏死因子α、IL-10和IL-8的浓度之间存在正相关关系。因此，抗PRMT5抗体的滴度与SSc的进展或缓解轨迹相关联。

 

 

 

热图显示第二验证组SSc患者血清中抗PRMT5抗体水平与细胞因子浓度（pg/ml）之间的相关性（n=42）。

 

为了阐明抗PRMT5抗体对SSc发展的影响，研究者用重组PRMT5蛋白对小鼠进行免疫接种。PRMT5免疫接种显示小鼠皮肤和肺部出现显著的炎症和纤维化，这伴随着多种促炎和促纤维化途径的上调，从而强调了抗PRMT5抗体在SSc中可能具有的重要作用。

本文研究表明抗PRMT5抗体表现为SSc的诊断和预测标志物，以及抗PRMT5抗体的应用可能有助于精确的疾病监测和预后评估。